稳定同位素、青志生物、稳定同位素标记

标记肽段回交的抑制

18O标记反应的另一个常见问题是标记肽段*发生回交。由于该标记反应是一种可逆反应，因此如果将18O标记完全的肽段溶于H216O中，仍能使18O标记肽段回复到16O标记状态。胰酶是造成回交的主要因素，稳定同位素标记，目前文献报道抑制回交的方法有酸中止法、超滤胰酶法和微波胰酶灭活法，都不能完全抑制胰酶的活性，稳定同位素法，置于H216O中仍能发生一定程度的回交。有研究采用化学灭活法，通过高浓度的还原试剂和烷ji化试剂，对溶液中残留的胰酶彻底灭活。胰酶灭活后，18O标记肽段在液相色谱流动相（2%yi腈-98%水-0.5%）中保存6d仍没有观察到明显的回交产物，稳定的标记肽段能在液相色谱中进行后续分离分析。

增强蛋白质酶切肽段的标记效率蛋白质酶切肽段18O标记方法的原理是基于胰蛋白酶催化产生的两次酶-肽段复合物水解反应。该反应是快速的动态可逆反应。因此，经常发生标记效率不完全和标记肽段发生回交的情况，稳定同位素结果分析，有效地控制标记和回交抑制这两个环节是实验成功的关键。有实验通过改善肽段在反应体系中的分散程度和辅助加热，增加反应效率来有效地提高标记效率。肽段在体系中的分散程度增高后，有利于肽段C端的完全暴露，增加与胰酶和H218O的接触机会。因此，改善肽段分散程度，能推进标记向正反应方向进行。在实验中，加入RapigestTMSF助溶剂，能增强蛋白质及多肽的溶解性，提高分散程度，利于H218O进行C末端羧基的交换反应。在α-酪蛋白酶切肽段18O标记产物质谱分析结果中，因为加入RapigestTMSF助溶剂，m/z1660，1267和2316的肽段的标记效率明显提高（图1A和图1D）。而未加入助溶剂组的3个肽段则标记不完全，仍然存在大量未标记的16O肽段。常规方法中，18O标记需要在37℃水浴中孵育24h，以达到充分反应的目的。但即便如此，温和的反应条件和较长的反应时间也难以保证标记完全。蛋白质酶切加上标记所耗费的时间**过36h，滞后了实验的进程。并且由于长时间置于水浴环境，*因为密封不严等情况引入H216O，稳定同位素，从而导致标记不完全。本实验采用微波加热的方式，不仅隔绝了潮湿的环境，而且只需要10min即可标记完全。与传统的水浴加热方法相比，由于微波使肽段的受热更为快速和均匀，因此能在很短时间内达到理想的标记效果。